Egy rendőr és egy szövőnő fiaként született 1819. augusztus 25-én a skóciai Glasgow-ban. Gyerekkora nélkülözések között telt, s miután apja munkája közben megsérült, és állás nélkül maradt, kádárinasnak kellett állnia. A munkások jogaiért küzdő chartista mozgalom tagjaként gyakran került szembe a brit hatóságokkal, a letartóztatás elől 1842-ben feleségével – akit az előző napon vett el – Kanadába szökött. A hajó Új-Skócia partjai előtt zátonyra futott, a friss házasok szó szerint egy fillér nélkül vergődtek partra. Pinkerton egyik barátja ösztökélésére átszökött az amerikai határon, és egy chicagói szeszfőzdében lett kádár. Néhány évvel később a közeli Dundee nevű, jobbára skót emigránsok lakta kis településen saját vállalkozásba kezdett, a rabszolgaság elleni küzdelmet is támogatta.
Nyomozói pályafutását a legenda szerint egy véletlen indította el. Az erdőben hordónak való fát keresve rábukkant egy pénzhamisító banda rejtekhelyére, majd a helyi seriffel együtt letartóztatták a bűnözőket. A bátor és becsületes fiatalember két helyi vállalkozó támogatásával újabb bűnbandákat leplezett le, és hamarosan ő volt a seriff „félállású” helyettese. Amikor azonban megpályázta a tisztséget, a választáson a kilenc jelölt közül utolsó lett: a helyiek nem tudták megbocsátani neki, hogy nem látogatta rendszeresen a templomot, és nem volt simulékony természet, ha problémája volt valakivel, hangosan adta az illető tudtára.
A kisvárosi politikától megcsömörlött Pinkerton visszaköltözött Chicagóba, ahol jobban méltányolták. Ő lett az akkor még csak harmincezer lakosú város első főállású rendőrnyomozója, pénzhamisításokat, emberrablásokat derített fel, és több, ellene elkövetett merényletet élt túl. A félelmet nem ismerő és megvesztegethetetlen férfi 1852-ben nyomozással foglalkozó céget alapított, amelynek mottója a „Sosem alszunk”, jelképe pedig a „mindent látó szem” volt, a köznyelvben csak „A szemként” emlegették – feltételezések szerint ez ihlette a magándetektív angol megnevezését (private eye).
A cég nem szűkölködött munkában: az Egyesült Államok egy jelentős része még a Vadnyugathoz tartozott, ahol nem volt sem törvény, sem közbiztonság. A Pinkerton Detektívügynökség két legnagyobb ügyfele a két működő szolgáltatás, a posta és a vasút lett, a nem működő harmadik, a rendőrség rovására.
Pinkerton és munkatársai csakhamar hírnevet vívtak ki maguknak kemény és hatékony fellépésükkel, ők voltak az elsők, akik aktákat vezettek a gyanúsítottakról, bűnügyi nyilvántartást hoztak létre, fényképek alapján azonosították a tetteseket, nem riadtak vissza attól sem, hogy beépüljenek a bandákba. Legnagyobb sikereik közé tartozott a Wild Bunchnak nevezett, vonat- és bankrablásra szakosodott bűnszövetkezet felmorzsolása, Butch Cassidy és a Sundance Kid elüldözése Dél-Amerikába.
Cége 1861 tavaszán, a polgárháború küszöbén a beiktatására vasúttal igyekvő Abraham Lincoln útját biztosította. Ügynökei, akik között ott volt az első női detektív, Kate Warne is, egy összeesküvés nyomára akadtak, amelynek résztvevői a baltimore-i pályaudvaron akartak végezni a megválasztott elnökkel. Pinkerton, aki még chicagói éveiből ismerte Lincolnt, figyelmeztette a veszélyre, és éjszaka, álruhában csempészte át a városon.
Lincoln hálából testőrének nevezte ki, és megbízta a titkosszolgálat megszervezésével. Ügynökei hírszerzésben és kémelhárításban is jeleskedtek, megakadályozták például a nyolcezer déli hadifogoly kiszabadítására szőtt összeesküvést, maga Pinkerton is több alkalommal indult álnéven és álruhában küldetésre annak tudatában, hogy ha felismerik, azonnal felakasztják.
A Pinkerton cég hírneve egyre nőtt, a lakosság szemében hősökké váltak, ponyvaregények zengték dicsőségüket. A vállalkozás azonban a nyilvánosság elől titkolt, féllegálisnak, esetenként törvényellenesnek számító eszközökkel, megtévesztéssel, megfélemlítéssel, emberrablással, sőt gyilkossággal is élt. Jesse James és bandája üldözése közben, miután egyik ügynöküket felismerték és meggyilkolták, bosszúból gyújtóbombát dobtak a bandita anyjának farmjára. A tűzben egy kisgyerek is meghalt, és a közvélemény felháborodása miatt fel kellett hagyniuk a hajszával, ez volt a Pinkerton cég egyik ritka kudarca. Gátlás nélkül szegődtek el sztrájkok letörésére, olykor a rendőrség oldalán, így vált az egykori munkásmozgalmi aktivistából a kapitalisták érdekeinek védelmezője.
Pinkerton nem ért rá a helyzet iróniáján töprengeni, annyira lekötötte a folyamatosan növekvő ügynökség ügyeinek intézése. Ellensúlyozandó az időről időre megjelenő negatív hangvételű cikkeket, gátlástalan öntömjénezésbe fogott, személyét és vállalkozását idilli fényben lefestő könyvek hosszú sorát íratta, sőt írta meg. A nem is kicsit kiszínezett, de reklámjuk szerint valódi, „az aktákból átvett” sztorikat tartalmazó történetek nagy hatást gyakoroltak az olvasókra, de nemcsak rájuk, hanem Sir Conan Doyle-ra, Mark Twainre, sőt később a modern, „kemény” detektívregény atyjának számító Dashiell Hammettre és Raymond Chandlerre is.
A hosszabb ideje betegeskedő Pinkerton 1884. július 1-jén halt meg, vélhetőleg agyvérzés következtében. A lapokban azonban az jelent meg, hogy felesége pudliját sétáltatta, amikor a póráz a lába köré tekeredett és elesett, közben elharapta nyelvét. Az esetnek nem tulajdonított különösebb jelentőséget, mire orvoshoz fordult, a sebtől vérmérgezést kapott, és már nem tudták megmenteni. Az ügynökséget fiai örökölték, akik egyre inkább a biztonsági és védelmi tevékenységre helyezték a hangsúlyt a nyomozással szemben, az egykori családi vállalkozás azóta részvénytársasággá vált.
